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基于T细胞招募抗体的生物学检测方法评估PD-1PD-L1抑制剂活性

文章作者:admin / 发表时间:2019-12-27 / 点击:

  原标题:基于T细胞招募抗体的生物学检测方法,评估PD-1/PD-L1抑制剂活性

  基于PD1/PD-L1的治疗给肿瘤治疗带来了革命性的改变,截止2018年底,超过100多种anti-PD1 和 anti-PDL1 处在研发的不同阶段,超过2000多个临床研究试验注册。抗体的特性需要通过生物学检测方法判定其生物学活性。在本文中,我们开发了一种基于细胞的生物学检测方式用来评估anti-PD1 和 anti-PDL1 抗体的生物学活性。我们选择了包含两个细胞系的受体报告系统,比较了超抗原,可溶性Anti-CD3抗体,膜型Anti-CD3抗体,嵌合抗原受体(CARs),双特异性T细胞招募抗体对效应细胞的激活。我们对该生物测定方法进行了表征,并证明其可用于分析anti-PD1和anti-PDL1的活性。所提出的生物测定方法可用于开发新的治疗药物及其表征方法。

  程序性死亡受体1(PD1)主要表达于激活的T细胞表面。PD-1+淋巴细胞与携带PD-1天然配体(PD-L1 或 PD-L2)的抑制性淋巴细胞结合后,将抑制PD-1+淋巴细胞的活性。PD1与其配体形成复合物导致了T细胞CD3依赖性激活被阻断。尽管与PD1相互作用的精确序列仍然不清楚,但是与PD1相互作用的蛋白质,以及受这种相互作用影响的信号级联已被确定。免疫反应的抑制,保护机体不受T淋巴细胞过度活化和自体免疫反应的影响,但同时也抑制了机体对肿瘤细胞的免疫反应。

  抑制PD1与PDL1的相互作用,而不是与PDL2相互作用,可以消除负性免疫调节,是治疗某些类型肿瘤最成功的策略之一。2018年,T. Honjo由于在免疫负性调节研究中的突出贡献,获得了诺贝尔生理医学奖。第一款PD-1和PD-L1抗体药物分别在2014年和2016年上市。截止2018年年底,有关PD1/PD-L1抑制剂的临床试验高达2000多项。

  治疗制剂的表征需要开发用于检测其生物活性的合理方法。理想情况下,生物学分析方法应当反映生物制剂的作用机制,实现定量比较生物制剂的不同。目前所使用的方法要么受到专利的限制,要么是基于人体原代细胞,这使得它们使用不方便,结果再现性差。我们的目的实构建一种用于检测anti-PD1 和antiPDL1抗体的生物学检测方法,免于专利和原代细胞使用的种种限制。

  基于pOGI载体(BIOCAD)构建pOGI-NFATFLuc 质粒;该载体包含萤火虫荧光素酶,受IL2启动子控制,该启动子中含有3个重复的NF-AT(激活的T细胞核因子)结合序列,该载体中还含有潮霉素抗性基因。

  基于pSX载体(BIOCAD),构建了pSX-tmaCD3, pSX-PD1,和 pSX-PDL1质粒。pSX-tmaCD3质粒包含抗人CD3抗体OKT3单链可变区片段scFv,融合了血小板生长因子受体跨膜区,融合基因受CMV启动子驱动,该载体也包含了嘌呤霉素抗性基因。pSX-PD1在多克隆位点插入了人PD-1基因,受CMV启动子控制。该载体包含新霉素抗性基因。pSX-PDL1包含了人PD-L1基因,受CMV启动子控制,该载体还包含新霉素抗性基因。

  Jurkat NFAT FLuc细胞系通过将pOGI-NFATFLuc载体电转化Jurkat细胞制备,在含有潮霉素B的培养基中培养筛选稳定细胞株。并通过加入aCD3,筛选在aCD3存在时,报告基因最高表达的稳转细胞株。

  Jurkat NFAT FLuc PD1细胞系通过将pSX-PD1 质粒电转化进Jurkat NFAT FLuc细胞制备,在含有新霉素的培养基中进行筛选,并通过流式细胞筛选表面高表达PD-1的细胞株。

  Raji PD-L1 细胞系通过将pSX-PDL1质粒电转化进Raji细胞,在含有新霉素的培养基中筛选,并通过流式细胞筛选高表达PD-L1的细胞系。

  根据方程,利用四参数logistic近似配位函数绘制细胞活化对抗体浓度的依赖关系曲线::

  其中x为抗体浓度,ng/ml;max是上渐近线;min是下渐进曲线,坡面是曲线为半有效浓度,ng/ml。

  取浓度为25 mg/ml 的aPD1和aPDL150 μl,分别置于PCR管中,置于PCR反应器中(BioRad, USA)在指定的温度下加热处理1h,随后的分析根据生物学功能分析操作指南进行。

  为了比较实验值与期望值之间的差异,分别根据标准品反应最大值,100μg/ml浓度为100%活性为参照,稀释aPD1 和 aPDL1抗体浓度分别为最大活性的200, 140, 70, 和50%。再根据生物学功能分析操作指南进行。活度计算为标准样品的实验测定的EC50与给定浓度的实验测定的EC50之比×100%。结果与分析

  在生物学分析中,最好使用永生化的细胞系来避免元代细胞准确性和重现性的问题。也可以通过基因工程手段得到想要的细胞表型。一个用于分析aPD1或 aPDL1抗体生物学活性的系统中,应该包括PD-1+的效应细胞和表达PD-L1的细胞。pd1介导的对CD3依赖激活的抑制意味着效应细胞必须在其表面携带有功能的CD3复合物。为了评估CD3依赖的激活,报告系统可以使用,例如荧光素酶报告系统。PD-L1和PD-1相互作用的结果是抑制了依赖于CD3激活的T细胞的NFAT 和NF-κB(核因子,激活B细胞的κ轻链增强子)信号。最好使用NFAT介导的通路,因为NF-κB信号可以被很多其它物质刺激,例如CD3依赖激活的特异性标志物较少。

  来自人T细胞的Jurkat细胞系符合用于CD3依赖的激活T细胞研究的要求,已经使用多达30年。在我们中,我们准备了NFAT FLuc PD1稳定细胞系,可以表达PD-1并且在NFAT反应的启动子下,控制着报告基因的表达。

  a)T cell受体(TCR)与特定肽形成复合物和主要组织相容性复合物(MHC)的相互作用最类似于其自身的作用机制(图1a);

  b)超级抗原可以结合在2型MHC(MHCⅡ)中TCR β链,这一结构模拟了TCR与MHC/Peptide形成复合物(图1b)。我们中用SEB作为超级抗原;

  d)跨膜型的anti-CD3ε抗体也经常用于aPD1和 aPDL1抗体的生物学分析(图1d);

  e)CAR+效应细胞是检测aPD1和aPDL1的一个有趣的选择。CAR的胞内结构域通常包含CD3ζ信号结构域,负责激活信号级联反应,类似于完整的CD3复合物(图1e)。据报道CAR-T治疗结合PD1/PDL1抑制子更加有效;

  图1.CD3激活方法在PD-1/PD-L1相互作用抑制剂生物学分析方法中的应用

  起初选择优化的CD3激活变体用于生物学分析开发,我们比较了可溶性的激活剂,例如αCD3抗体,aCD3/aTAA1,aCD3/aTAA2, 和SEB超抗原(图2),通过两个参数进行评价:绝对激活(包含效应细胞、靶细胞、激活剂和aPD1的系统中的发光强度)和相对激活(系统中的发光强度之比,即在上述系统中含有和不含有aPD1二者发光强度之比)。在含有aCD3/aTAA1和aCD3/aTAA2 激活剂的系统中,发光强度是含有aCD3 和SEB激活剂系统发光强度的2-3倍。需要注意的是aCD3 和SEB在本实验中的使用浓度是用于T细胞招募浓度的1000倍和100倍。与上述CD3激活因子不同,可溶性aCD3激活了所有效应细胞,而不仅仅是那些直接与靶细胞相互作用的细胞。当使用PDL1+靶细胞时,PD1介导的CD3依赖性激活的抑制作用仅在某些效应细胞中存在。这造成了背景信号和较低的相对激活。在有aCD3/aTAA1 和aCD3/aTAA2系统中,相对激活为5-6倍,aCD3 相对激活为1.5倍,SEB系统中相对激活为2倍。因此aCD3 和SEB激活剂相对于T细胞招募剂有较低的绝对激活和相对激活,在后续的研究讨论中排除。而且SEB属于有毒物质,在生物分析中不太受欢迎,如果有其它替代品时要慎用SEB.

  aCD3/aTAA的两种变体、跨膜aCD3的靶细胞和CAR+ 的效应细胞(图4)。在含有CAR+效应细胞的系统中,绝对激活高出其它激活形式的5倍。两种aCD3/aTAA变体的相对激活是跨膜激活剂的2-3倍。同时,aCD3/aTAA1比aCD3/aTAA2的相对激活度高。基于这些数据,我们选择aCD3/aTAA1激活CD3。

  为了证明所开发的生物测定法的特异性,我们用aPD1、aPDL1、aCTLA4和aHER2进行了检测(图5)。在本生物实验中CD3依赖激活的抑制是通过效应细胞和靶细胞上分别存在的PD1和PDL1来保证的。NF-AT调控的荧光素酶的表达,是在加入aPD1 或aPD-L1 重激活效应细胞而实现的,aCTLA4 或 aHER2不能实现效应细胞的重激活。样品的发光强度与抗体浓度的关系可以用四参数逻辑斯蒂方程来描述,这使得比较被测样品的EC50值成为可能。

  100%激活为基准,设置aPD-1 和 aPD-L1在预测标准值50,70.100,140,200% 5个浓度值激活该系统,测定发光强度(图7)。实验结果表明,这些制剂的活性接近预期值。该系统在aPD-1和aPDL-1标准的50-200%的活性范围内是线性的。

  我们开发了一种生物测定法来评价aPD-1和aPDL-1的生物活性。生物测定包括三种成分(图8):(i)在表面呈现PD1的效应报告细胞系,其基因组中含有NF-AT反应元件启动子控制下的萤火虫荧光素酶报告基因;(ii)表面存在PD-L1的细胞系;(iii)双特异性aCD3/aTAA抗体,用于激活报告细胞系中CD3依赖性NF-AT 信号,并将报告细胞与配体提呈细胞结合。

  值得注意的是,T细胞中CD3激活的两个被考虑的变体——双特异性aCD3/aTAA和CAR ,这是以前在测试PD1/PDL1抑制剂时没有描述过的原始方法。早前报道了基于跨膜aCD3的aPD1或aPDL1活性评价系统。然而,这种方法是有专利保护的,使用范围有限。我们开发了可以在aPD-1和aPDL-1开发阶段使用的生物测定法,用于候选分子的比较和稳定性评估,以及对许多治疗性制剂的表征,以确认它们的等价性,即,通常情况下,80-125%的标准抗体活性,线性范围符合预期。



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